熒光光度計(jì)的操作要點(diǎn)?

一、操作前準(zhǔn)備：奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

1. 儀器與環(huán)境檢查

• 儀器狀態(tài)確認(rèn)：開(kāi)機(jī)前檢查電源、數(shù)據(jù)線連接是否牢固，樣品室門(mén)是否關(guān)閉（部分儀器需 “關(guān)門(mén)" 狀態(tài)才能啟動(dòng)），檢測(cè)器、光源（如氙燈）是否處于正常待機(jī)狀態(tài)（氙燈壽命有限，避免頻繁開(kāi)關(guān)）。

• 環(huán)境控制：

• 溫度：保持實(shí)驗(yàn)室溫度穩(wěn)定（通常 20-25℃），避免溫度波動(dòng)導(dǎo)致儀器部件（如光電倍增管）靈敏度變化；

• 濕度：濕度≤60%，防止光學(xué)元件受潮發(fā)霉（可配備除濕機(jī)）；

• 避光：關(guān)閉樣品室附近強(qiáng)光（如直射燈光），避免環(huán)境光干擾熒光信號(hào)檢測(cè)；

• 防震：儀器需放置在穩(wěn)定臺(tái)面上，遠(yuǎn)離離心機(jī)、真空泵等震動(dòng)源，防止光學(xué)系統(tǒng)錯(cuò)位。

2. 試劑與樣品準(zhǔn)備

• 試劑純度：空白溶劑（如去離子水、乙醇）需 “熒光級(jí)" 或高純度（如 HPLC 級(jí)），避免雜質(zhì)自身熒光干擾；標(biāo)準(zhǔn)品需準(zhǔn)確稱(chēng)量、配制，濃度梯度覆蓋樣品預(yù)期濃度（通常 5-7 個(gè)梯度，確保線性關(guān)系）。

• 樣品預(yù)處理：

• 去除雜質(zhì)：若樣品含懸浮物、顆粒物，需通過(guò)離心（3000-5000rpm，5-10min）或 0.22μm 濾膜過(guò)濾，防止堵塞樣品池或散射光干擾；

• 濃度適配：樣品濃度過(guò)高易導(dǎo)致 “熒光猝滅"（信號(hào)飽和），需提前稀釋至線性范圍內(nèi)（可先做預(yù)實(shí)驗(yàn)判斷濃度范圍）；

• pH 調(diào)節(jié)：部分物質(zhì)熒光強(qiáng)度受 pH 影響顯著（如氨基酸、黃酮類(lèi)），需用緩沖液（如 Tris-HCl、磷酸鹽緩沖液）調(diào)節(jié)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品 pH 一致。

3. 樣品池選擇與清潔

• 材質(zhì)適配：

• 常用石英樣品池（透光性好，紫外 - 可見(jiàn)區(qū)無(wú)吸收），避免使用玻璃池（玻璃對(duì)紫外光有吸收，會(huì)削弱激發(fā)光）；

• 根據(jù)樣品體積選擇規(guī)格（如 10mm 光程、3.5mL 容量的石英池為常規(guī)款），確保樣品量覆蓋光程（液面需高于進(jìn)光孔 2-3mm）。

• 清潔流程：

1. 新樣品池先用 10% 硝酸浸泡 2-4h，再用去離子水沖洗 3-5 次，烘干備用；

2. 每次使用后，立即用樣品溶劑（如乙醇）沖洗 3 次，再用去離子水沖洗，最后用無(wú)塵紙吸干外壁水分（避免擦拭內(nèi)壁，防止劃痕）；

3. 若樣品殘留（如蛋白質(zhì)、油脂），可用超聲清洗儀（20-30℃，5-10min）清洗，禁用強(qiáng)腐蝕性試劑（如濃鹽酸）。

二、核心操作步驟：規(guī)范流程保準(zhǔn)確

1. 儀器啟動(dòng)與預(yù)熱

1. 打開(kāi)電腦，啟動(dòng)熒光光度計(jì)控制軟件（如 PerkinElmer 的 FL WinLab、Hitachi 的 F-7000 軟件）；

2. 開(kāi)啟儀器主機(jī)電源，選擇 “氙燈" 或?qū)?yīng)光源（部分儀器需手動(dòng)點(diǎn)亮光源），預(yù)熱 30min（關(guān)鍵步驟！光源和檢測(cè)器需穩(wěn)定后才能檢測(cè)，否則信號(hào)漂移大）；

3. 預(yù)熱期間，在軟件中設(shè)置儀器參數(shù)（提前規(guī)劃，減少預(yù)熱后等待時(shí)間）。

2. 參數(shù)設(shè)置：匹配物質(zhì)熒光特性

3. 空白校正：消除背景干擾

• 目的：扣除溶劑、樣品池、環(huán)境光的背景熒光信號(hào)，確保檢測(cè)信號(hào)僅來(lái)自待測(cè)物質(zhì)。

• 操作：將空白溶劑注入石英池（液面至刻度線，避免外壁殘留液體），用無(wú)塵紙擦拭外壁后，放入樣品室的 “樣品架" 中（注意方向：光程面正對(duì)光路，不可反放），點(diǎn)擊軟件 “空白校正" 或 “調(diào)零"，待校正完成后取出空白池。

4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1. 按濃度從低到高的順序，依次將標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入樣品池，放入樣品室，點(diǎn)擊 “測(cè)量"，記錄每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度（F）；

2. 測(cè)量完一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品后，用下一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液潤(rùn)洗樣品池 2-3 次（避免交叉污染），再注入新溶液測(cè)量；

3. 全部標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)量完成后，在軟件中以 “濃度（C）" 為橫坐標(biāo)、“熒光強(qiáng)度（F）" 為縱坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程（R2 需≥0.998，否則需重新配制標(biāo)準(zhǔn)品）。

5. 樣品檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理

1. 用樣品溶液潤(rùn)洗樣品池 2-3 次，注入樣品溶液，放入樣品室，點(diǎn)擊 “測(cè)量"，記錄樣品的熒光強(qiáng)度（F 樣）；

2. 若樣品需稀釋?zhuān)栌涗浵♂尡稊?shù)（n），將 F 樣代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品的 “稀釋后濃度"，再乘以 n 得到 “樣品原始濃度"；

3. 每個(gè)樣品建議平行測(cè)量 3 次，取平均值（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 需≤5%，確保重復(fù)性）。

6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后操作

1. 關(guān)閉光源（如氙燈），等待儀器冷卻 10-15min 后，關(guān)閉主機(jī)電源和電腦；

2. 立即清洗樣品池（按 “操作前準(zhǔn)備" 中的清潔流程），晾干后收納；

3. 清理樣品臺(tái)，記錄儀器使用日志（包括使用時(shí)間、樣品類(lèi)型、光源狀態(tài)、異常情況等）；

4. 關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室電源、空調(diào)、燈光，確保環(huán)境安全。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)：規(guī)避誤差與儀器損傷

1. 光源使用禁忌：

• 氙燈啟動(dòng)后需預(yù)熱穩(wěn)定，禁止在預(yù)熱過(guò)程中關(guān)閉電源（易導(dǎo)致燈管損壞）；

• 單次使用時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)（建議≤4h），若中途暫停實(shí)驗(yàn)，可開(kāi)啟 “待機(jī)模式"（部分儀器有此功能），而非頻繁開(kāi)關(guān)光源。

2. 樣品池操作規(guī)范：

• 拿取樣品池時(shí)，僅接觸磨砂面（避免指紋污染透光面，指紋會(huì)產(chǎn)生散射光，干擾信號(hào)）；

• 樣品池放入樣品室時(shí)，需確保 “定位準(zhǔn)確"（部分儀器樣品架有卡槽），若位置偏移，會(huì)導(dǎo)致光程不一致，數(shù)據(jù)偏差。

3. 信號(hào)干擾防控：

• 避免樣品中含強(qiáng)熒光雜質(zhì)（如灰塵、有機(jī)物），若空白信號(hào)過(guò)高，需更換更高純度的溶劑或重新預(yù)處理樣品；

• 檢測(cè)過(guò)程中禁止打開(kāi)樣品室門(mén)（開(kāi)門(mén)會(huì)導(dǎo)致環(huán)境光進(jìn)入，信號(hào)驟升，甚至損壞光電倍增管）。

4. 數(shù)據(jù)有效性判斷：

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差：檢查標(biāo)準(zhǔn)品是否變質(zhì)、配制是否準(zhǔn)確，或儀器參數(shù)（如狹縫、PMT 電壓）是否合適；

• 樣品信號(hào)飽和（超過(guò)滿(mǎn)量程）：需稀釋樣品后重新檢測(cè)，避免 “熒光猝滅" 導(dǎo)致結(jié)果偏低；